Laboratorio di Biofisica Molecolare

Biofisica Molecolare
Scienze - Palazzina 1 - Primo Piano
Attività di ricerca
Staff
Strumentazione
Attività di ricerca
Le attività di ricerca svolte presso il Laboratorio di Biofisica Molecolare riguardano la caratterizzazione strutturale di molecole e di macromolecole di interesse biologico principalmente mediante tecniche di diffusione a piccolo angolo e di diffrazione di raggi X e di neutroni. Si fa notare che i ricercatori del Laboratorio di Biofisica Molecolare sono frequent users delle Large Scale Facilities di luce di sincrotrone e di neutroni nazionali e europee. (clicca sulle immagini per ingrandirle) Il reattore nucleare dell'Institut Laue-Langevin, Grenoble (F) Esperimenti SAXS al sincrotrone di Amburgo (D)
Principali linee di ricerca
Le principali linee di ricerca comprendono lo studio dei meccanismi di autoassemblaggio della guanosina e di suoi derivati e la propagazione della chiralità, l’analisi della struttura e della stabilità di fasi lipidiche e di vescicole unilamellari e la caratterizzazione delle proprietà strutturali e di aggregazione di proteine in soluzione.
Autoassemblaggio della guanosina
Nell’ambito di questa linea di ricerca, vengono analizzati i processi di self-assembling della guanosina e di alcuni dei sui derivati (anche lipofili), che portano alla formazione di macroaggregati elicoidali a quattro filamenti (quadruplexes) e le modalità di aggregazione di dsDNA e ssDNA a corta catena, parzialmente complementari e perciò capaci di dare origine a nanostars con differente valenza. Questi sistemi sono oggetto di un intenso lavoro teorico e sperimentale, che in questo momento riguarda le proprietà strutturali delle quadrieliche e i contributi termodinamici che ne determinano lunghezza e stabilità, il meccanismo gerarchico di auto-assemblaggio in soluzione diluita, lo switching strutturale tra nanoribbons e nanowires osservato in solventi organici in presenza e assenza di controioni, il meccanismo con cui viene trasmesso l’ordine a lungo raggio e la formazione di fasi liotropiche liquido-cristalline, la propagazione della chiralità, la condensazione promossa in soluzione acquosa da controioni, la separazione di fase in osmoliti e la formazione di hydrogels. E’ importante osservare che da un punto di vista biologico, la formazione dei quadruplessi può essere messa in relazione con certe proprietà biofisiche della cromatina, con il meccanismo d'azione della telomerasi e di alcuni farmaci antitumorali e addirittura con l'origine prebiotica della molecola di DNA.
Polimorfismo liotropico del DNA. La molecola è schematizzata come un cilindro. L'immagine è stata ottenuta al microscopio polarizzatore, in un campione di DNA con gradiente di concentrazione Struttura di un quadruplesso formato da GMP sale di potassio. L'immagine è stata ottenuta per diffrazione dei raggi X da un campione di fibre. Self-assembling della GMP: struttura molecolare di un tetramero, un ottamero e un quadruplesso di GMP. La sfera rossa rappresenta uno ione alcalino. Self-assembling di derivati lipofili della guanosina in solventi organici. In assensa di ioni alcalini, gli aggregati sono nastri planari a differente conformazione
Struttura e stabilità di fasi lipidiche
Nel caso di sistemi lipidici, gli aspetti che vengono maggiormente considerati riguardano la caratterizzazione strutturale delle fasi liotropiche e del polimorfismo lipidico in funzione di differenti parametri sperimentali (quali, ad esempio, composizione, temperatura, pressione meccanica, presenza di controioni, pH, solventi organici), l'analisi dei meccanismi di accrescimento e di trasformazione degli aggregati macromolecolari, lo studio della stabilità delle diverse fasi e degli aggregati stessi (basati sull’analisi dei differenti contributi energetici e molecolari che ne determinano la stabilità), lo studio delle proprietà di idratazione e le possibili implicazioni biologiche legate all capacità di autoaggregazione  e al comportamento polimorfico (con particolare riferimento alle fasi lipidiche non-lamellari). Recentemente, questa linea di ricerca si è sempre di più focalizzata sul problema del drug delivery, studiando le proprietà strutturali e la stabilità termica e relativa alla composizione di nanoparticelle lipidiche da utilizzare come carriers stabili e biocompatibili per differenti tipi di farmaci. Le attività di ricerca riguardano in particolare le solid lipid nanoparticles, i cubosomi (ottenuti per sonicazione dopo aggiunta di opportuni tensioattivi dalle fasi cubiche di monogliceridi) e gli esasomi (anche questi ottenuti per sonicazione da fasi esagonali lipidiche in presenza di opportuni tensioattivi).
Polimorfismo lipidico: diagramma di fase teorico per sistemi rigorsamente liotropici. La struttura delle diverse fasi è mostrata in forma schematica: a,b,c, d, fasi cubiche; H_I e H_II, fasi esagonali diretta e inversa; La, fase lamellare liquido-cristallina. Polimorfismo lipidico: diagramma di fase sperimentale della monooleina in acqua. La figura mostra in forma schematica la struttura delle diverse fasi. Le due fasi cubiche sono bicontinue.  MAD, Monoolein Aqueous Dispersions: immagini al microscopio elettronico di nanoparticelle ottenute per dispersione di fasi cubiche di monooleina in acqua e utilizzate per veicolare farmaci. Gli spettri FFT (mostrati nelle riquadrature) confermano la presenza di cubosomi.
Giant Unilamellar Vesicles

Le Giant Unilamellar Vesicles (GUV) sono vescicole lipidiche unilamellari con dimensioni paragonabili a quelle della cellula (diametro di 1-100 μm) e che possono essere visualizzate mediante microscopia ottica. Le GUV costituiscono uno strumento estremamente utile e versatile per lo studio in vitro delle proprietà di membrane lipidiche e della loro interazione con macromolecole biologiche, dato che è possibile riprodurre, variando la composizione lipidica e inserendo componenti specifici (come colesterolo e proteine), le caratteristiche principali della membrana plasmatica. Presso il Laboratorio di Biofisica Molecolare è stato messo a punto un sistema per la produzione delle GUV basato sul modello della camera di flusso impiegata nei processi di elettroporazione ed è disponibile un sistema ottico (telecamera e macchina fotografica digitale) per la registrazione delle immagini ottenute al microscopio polarizzatore. In questo momento, l’attività di ricerca riguarda le caratteristiche di stabilità termica ed osmotica delle GUV, il loro comportamento al variare di parametri intrinseci come la composizione lipidica e la temperatura, e l’effetto delle interazioni con proteine native e fibrillate, come recentemente riportato nel caso di liposomi che modellizzano la membrana cellulare (vedi articolo scaricabile gratuitamente qui).

Preparazione di GUV (Giant Unilamellar Vesicle) per elettroformazione con corrente alternata. La cella di crescita è fatta utilizzando due vetrini di  indium tin oxide (ITO)-covered glass appoggiati uno contro l'altro su uno spaziatore di teflon. GUVs di POPC (palmitoil-oleil-fosfatidilcolina). Le immagini al microscopio ottico mostrano come le GUVs inglobino gradualmente le protrusioni generate da fenomeni di budding e pearling. Stabilità termica di GUVs di POPC formate in presenza di fibre amiloidi di citocromo C. Le immagini sono state ottenute al microscopio ottico in funzione della temperatura.
Proprietà strutturali e di aggregazione di proteine in soluzione
Questa linea di ricerca riguarda sia proteine modello, la cui struttura atomica è nota, sia proteine non ancora cristallizzate o in condizioni non native. Mediante tecniche di diffusione a piccoli angoli dei raggi X e dei neutroni (SAXS e SANS) viene studiata la struttura, la stabilità e i processi di folding/unfolding/misfolding di proteine in soluzione. L’influenza della temperatura, della pressione meccanica o di particolari proprietà del solvente acquoso (come presenza di cosolventi, forza ionica e pH) nella stabilità delle proteine in soluzione, rappresentano alcuni fra i problemi attualmente di nostro interesse in questo ambito.
Nel caso di proteine non ancora cristallizzate, l’analisi mediante SAXS o SANS riguarda la determinazione della forma, dimensioni e stato di aggregazione del sistema di interesse, ma anche la valutazione delle variazioni conformazionali indotte da agenti esterni (come in questo articolo scaricabile gratuitamente qui), che possono essere la chiave per comprendere alcune funzioni biologiche. Recentemente abbiamo studiato la potenzialità di alcuni composti simili alla curcumina per inibire l’aggregazione della proteina chiave del morbo di Parkinson (articolo leggibile gratuitamente qui).
I metodi sviluppati, principalmente basati su approcci di global fitting, sono stati raccolti in una suite di programmi shareware (GENFIT, SASMOL, MPOLE, GRAFIT e QUAFIT) e validati dallo Scientific Software Group di ESRF (Grenoble) e quindi inclusi tra il software scientifico messo a disposizione degli utilizzatori del sincrotrone e della sorgente nucleare ILL presente nel sito di Grenoble (http://www.esrf.eu/Instrumentation/software/data-analysis ).
Copertina del Biophysical Journal del 6 gennaio 2010, che schematizza i potenziali di interazione tra due proteine, come ottenuti dall'analisi mediante GENFIT di curve SAXS da BSA (l'albumina di siero bovino) in soluzione concentrata. Copertina del Biophysical Journal dell'8 agosto 2012, che schematizza le proprietà strutturali e di aggregazione della emocianina di Octopus Vulgaris in soluizone, come ottenuti dall'analisi mediante QUAFIT di curve SAXS e SANS. Analisi SAXS di proteine in soluzione: la struttura tetramerica della Carbossi Peptidase di Sulfolobus solfataricus in soluzione è confermata dal confronto con la forma ricostruita a partire da curve SAXS mediante MPOLE. Fibre amiloidi preparate a partire da citocromo C in soluzione diluita. L'immagine è ottenuta con un microscopio polarizzatore con Nicol incrociati. Esperimenti SAXS al sincrotrone di Grenoble (ESRF)
Principali progetti di ricerca in corso
Attualmente sono in corso due progetti di ricerca nazionali finanziati dal Ministero dell’Istruzione, dell’Università e della Ricerca (MIUR) e uno finanziato sempre dal MIUR per tramite della Sincrotrone Trieste per sostenere attività derivanti da accordi internazionali relativi al progetto ESS (European Spallation Source):
- PRIN 2010LKE4CC: il progetto riguarda lo studio del comportamento di fase di costrutti auto-assemblanti di DNA, al fine di sfruttare la selettività delle interazioni nel DNA per produrre nuovi materiali con applicazioni nella sensoristica molecolare, la diagnostica ed il trasporto di farmaci. (Responsabile Paolo Mariani)
- FIRB 2012, RBFR12SIPT: il progetto è focalizzato allo studio di diversi sistemi neuro-protettivi che possano influenzare il processo di aggregazione del peptide beta amiloide (Aβ), legato al Morbo di Alzheimer, bloccandone così la patogenesi. La determinazione di agenti influenti sul pattern aggregativo del peptide Aβ parte sia da studi prettamente chimici e fisici, sia da innovative considerazioni biologiche/mediche. (Responsabile e Coordinatrice Nazionale Maria Grazia Ortore)
- IPHONE: il progetto prevede lo sviluppo di un sistema integrato porta-campione per soluzioni proteiche per misure simultanee di scattering neutronico e dicroismo circolare e per misure risolte in tempo dopo mescolamento rapido. (Responsabile Paolo Mariani).
Staff
071-2204608
071-2204608
071-2204608
Mario Pergolini
Tecnico di Laboratorio
071-2204608
Dott. Caterina Ricci
Dottoranda
071-2204608
Dott. Silvia Moscatelli
Dottorando
071-2204608
Dott.ssa Federica Carducci
Dottoranda
Dott. Benedetta Come
Dottoranda
Dott. Paolo Moretti
Dottorando
Strumentazione
Tecniche sperimentali
Le tecniche sperimentali utilizzate sono la diffrazione dei raggi X (impiegate per lo studio dei sistemi liotropici) e la diffusione a piccolo angolo dei raggi X e dei neutroni (impiegate per lo studio strutturale delle proteine in soluzione e di sistemi liotropici in soluzione diluita). Gli esperimenti di diffrazione dei raggi X vengono svolti utilizzando i due generatori a disposizione del gruppo di Biofisica Molecolare presso il DiSVA, mentre gli esperimenti di diffusione a piccolo angolo vengono effettuati presso le principali sorgenti europee di neutroni (ILL a Grenoble, FMRII a Munich e LLB a Saclay) o presso grandi laboratori di luce di sincrotrone (ESRF a Grenoble, PETRAIII ad Amburgo, Elettra a Trieste e LNLS in Brasile).
Il sincrotrone Europeo ESRF (European Synchrotron Radiation Facility) di Grenoble (F) Le sorgenti di luce Elettra (sincrotrone) e FERMI (free-electron laser) di Trieste
Centrifuga Hermle Z200A per falcon - completo di rotore
Microcentrifuga ALC 4214
Bilancia analitica Mettler AE163
Sistemi per elettroforesi BioRAD
Vaschetta ultrasuoni Bransonic  
Microscopio stereo Zeiss
SpeedVAC per concentrazione/evaporazione
Produttore acqua distillata USF PureLab - Steroglass
Incubatore refrigerato Generalcontrol 
Scanner per image plates, DENOPTIX
Miscroscopio a luce polarizzata Leitz Ortolux con controllo di temperatura e telecamera digitale
Miscroscopio a contrasto di fase Leica DMLS
Generatore Philips DY673 con monocromatore e camera di Guiner con Image Plate
Generatore Ital-Structures C3K5 con monocromatore e camera di Guinier con Image Plate
Macchina fotografica digitale Nikon D5100
Liofilizzatore Edwards
Sistema  per elettroporazione e cellule con elettrodi
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