Laboratorio di Biofisica Molecolare

Idrogel di guanosine

Questa linea di ricerca è incentrata sullo studio di un sistema di G-quadruplexes formati da miscele di guanosina (GMP) e guanina (Gua), una molecola con la stessa base azotata della GMP. Le strutture elicoidali che si auto-assemblano tramite il meccanismo di π-stacking interagiscono in modo mediamente più attrattivo rispetto alle strutture formate da campioni contenenti soltanto GMP, in quanto le molecole Gua sono prive di carica. La presenza di stabili interazioni elica-elica porta quindi alla formazione di un idrogel fisico, con una complessa architettura supramolecolare.

Tecniche come microscopia a forza atomica (AFM), microscopia elettronica a scansione (SEM), spettroscopia UV-Vis, SAXS e SANS sono molto utili per la caratterizzazione strutturale di questo idrogel. È possibile, ad esempio, studiare come cambiano le proprietà chimico-fisiche del sistema auto-assemblato, in funzione del rapporto stechiometrico GMP:Gua nella miscela.

Un'altra importante parte della ricerca riguarda lo studio delle applicazioni biotecnologiche in cui il G-idrogel potrebbe essere implicato. È noto che sistemi simili vengono utilizzati nel campo dell'ingegneria tissutale per la rigenerazione cutanea, nel settore farmaceutico come veicolanti di farmaci e così via.

Attualmente, nel Laboratorio di Biofisica Molecolare si stanno studiando due possibili applicazioni:

studio della diffusione di molecole fluorescenti inglobate all'interno di G-idrogel per valutarne le proprietà dinamiche;

impiego di G-idrogel per veicolare micro-cristalli di proteine direttamente sul fascio dei raggi X, al fine di ricavare la loro struttura (collaborazione con il gruppo Dynamop, presso Institute de Biologie Structurale a Grenoble).

Struttura e stabilità di fasi lipidiche

Nel caso di sistemi lipidici, gli aspetti che vengono maggiormente considerati riguardano:

• la caratterizzazione strutturale delle fasi liotropiche e del polimorfismo lipidico in funzione di differenti parametri sperimentali (quali, ad esempio, composizione, temperatura, pressione meccanica, presenza di controioni, pH, solventi organici);

• l'analisi dei meccanismi di accrescimento e di trasformazione degli aggregati macromolecolari;

• lo studio della stabilità delle diverse fasi e degli aggregati stessi (basati sull'analisi dei differenti contributi energetici e molecolari che ne determinano la stabilità);

• lo studio delle proprietà di idratazione e le possibili implicazioni biologiche legate all capacità di autoaggregazione e al comportamento polimorfico (con particolare riferimento alle fasi lipidiche non-lamellari);

• i difetti nelle membrane modello dovuti alla formazione spontanea di pori d'acqua o alla presenza di proteine di membrana studiati analizzando i dati SAXS con innovativi modelli basati sulla possibile presenza di correlazioni orizzontali tra questi difetti.

Recentemente, questa linea di ricerca si è sempre di più focalizzata sul problema del drug delivery, studiando le proprietà strutturali e la stabilità termica e relativa alla composizione di nanoparticelle lipidiche da utilizzare come carriers stabili e biocompatibili per differenti tipi di farmaci.

Le attività di ricerca riguardano in particolare le solid-lipid nanoparticles, i cubosomi (ottenuti per sonicazione dopo aggiunta di opportuni tensioattivi dalle fasi cubiche di monogliceridi) e gli esasomi (anche questi ottenuti per sonicazione da fasi esagonali lipidiche in presenza di opportuni tensioattivi).

Vescicole unilamellari giganti

Le Giant Unilamellar Vesicles (GUV) sono vescicole lipidiche unilamellari con dimensioni paragonabili a quelle della cellula (diametro di 1-100 μm) e che possono essere visualizzate mediante microscopia ottica. Le GUV costituiscono uno strumento estremamente utile e versatile per lo studio in vitro delle proprietà di membrane lipidiche e della loro interazione con macromolecole biologiche, dato che è possibile riprodurre, variando la composizione lipidica e inserendo componenti specifici (come colesterolo e proteine), le caratteristiche principali della membrana plasmatica.

Presso il Laboratorio di Biofisica Molecolare è stato messo a punto un sistema per la produzione delle GUV basato sul modello della camera di flusso impiegata nei processi di elettroporazione ed è disponibile un sistema ottico (telecamera e macchina fotografica digitale) per la registrazione delle immagini ottenute al microscopio polarizzatore.

Recentemente, l'attività di ricerca riguarda le caratteristiche di stabilità termica ed osmotica delle GUV e il loro comportamento al variare delle condizioni chimico-fisiche, come:

• la composizione lipidica e la temperatura;

• le interazioni con biosurfattanti (mono- e di-ramnolipidi)

• le interazioni con proteine native e fibrillate.

Struttura, stabilità, aggregazione e interazione di proteine in soluzione

Questa linea di ricerca riguarda sia proteine modello, la cui struttura atomica è nota, sia proteine non ancora cristallizzate o in condizioni non native. Nel nostro gruppo di ricerca utilizziamo prevalentemente tecniche di diffusione a piccolo angolo dei raggi X e dei neutroni (SAXS e SANS) con cui determiniamo le seguenti proprietà:

• ricostruzione della forma di proteine;

• interazione tra proteine in soluzione;

• proprietà strutturali di proteine sottoposte a pressione meccanica;

• proprietà di aggregazione delle proteine in soluzione;

• proteine in solventi misti;

• predizione di strutture di proteine mediante SAS e nuovi approcci bioinformatici;

• processi di formazione di amiloidi;

• proteine intrappolate su strati polimerici;

• aggregazione di proteine costituite da domini con struttura terziaria nota e connessioni flessibili con struttura primaria nota;

• metodi variazionali di tipo bayesiano per lo studio di proteine intrinsecamente disordinate.

In tali studi sono state sviluppate strategie innovative per l'analisi dei dati, che consentono di ottenere informazioni strutturali e termodinamiche più dettagliate rispetto a quelle fornite dagli approcci tradizionali.

I metodi sviluppati, principalmente basati su approcci di global fitting, sono stati raccolti in una suite di programmi shareware: GENFIT, SASMOL (scaricabili dal sito https://sites.google.com/site/genfitweb/), QUAFIT, VBWSAS, MPOLE e GRAFIT (disponibili su richiesta a e-mail).

Nell'ultimo decennio i nostri interessi si sono focalizzati su proteine intrinsecamente disordinate e legate a patologie neurodegenerative quali l'Alzheimer ed il Parkinson, che abbiamo studiato in presenza di agenti biologici (chaperonine) e chimici (molecole simili alla curcumina) per la progettazione di nuovi approcci terapeutici a tali patologie. Attualmente stiamo studiando la capacità inibitoria nell'aggregazione patologica di proteine da parte di prodotti derivanti da scarti agricoli, in una prospettiva di economia circolare.

Abbiamo sviluppato nuovi metodi per studiare le proprietà delle proteine intrinsecamente disordinate (IDP) combinando misure SAXS o SANS con insiemi conformazionali determinati da tecniche Molecular Dynamics o Monte Carlo.

Diverse collaborazioni sono attualmente in corso per lo studio della stabilità e dell'attività di proteine legate al SARS-CoV-2 e a patologie rare.

Applicazione di spettroscopia FTIR e spettroscopia Raman a sistemi fisici, chimici e biologici

Le tecniche FTIR e Raman sono spettroscopie vibrazionali che permettono di studiare la composizione chimica di un campione sfruttando i modi vibrazionali specifici di ogni legame chimico. Tramite queste tecniche, anche accoppiate a un microscopio ottico – Microspettroscopie FTIR e Raman – si può ottenere la fingerprint del campione in esame in maniera oggettiva e rapida. I campi di applicazione di queste tecniche sono innumerevoli e quelli a cui ci dedichiamo attualmente includono:

• valutazione delle proprietà chimico-fisiche di nuovi composti/sistemi bioattivi per mettere a punto il loro design e la loro veicolazione;

• studio di interazioni drug/cell per la valutazione delle modificazione biochimiche indotte dall'azione del composto in studio e/o per tracciare la sua localizzazione a livello subcellulare

• sviluppo di metodi di “spectral pathology”, ossia di metodologie basate su Imaging FTIR e Raman che lavorino a supporto delle procedure di routine attualmente in uso per individuare le modifiche chimiche che precedono o accompagnano le più note modificazioni morfologiche in un sistema biologico a seguito dell'insorgenza di una patologia

• caratterizzazione chimico-fisica dell'organizzazione strutturale e caratteristiche chimiche del collagene e il suo ruolo in alcune patologie umane, nonché la sua correlazione con i “tumor microenvironment”

Principali progetti di ricerca in corso

Attualmente siamo coinvolti in due progetti PNRR.

Il primo, VITALITY, è inerente l'Ecosistema Innovazione, digitalizzazione e sostenibilità per l'economia diffusa nel Centro Italia e riguarda lo studio di materiali bio-nanostrutturati auto-assemblanti.

Il secondo, National Biodiversity Future Center, è focalizzato allo sviluppo di sensori capaci di rivelare quantità davvero esigue di nuovi inquinanti.

Strumentazione di laboratorio

• Zetasizer Malvern per Dynamic Light ScatteringZetasizer Malvern per Dynamic Light Scattering

• Centrifuga Hermle Z200A per falcon - completo di rotore

• Microcentrifuga ALC 4214

• Bilancia analitica Mettler AE163

• Sistemi per elettroforesi BioRAD

• Vaschetta ultrasuoni Bransonic  

• Microscopio stereo Zeiss

• SpeedVAC per concentrazione/evaporazione

• Produttore acqua distillata USF PureLab - Steroglass

• Incubatore refrigerato Generalcontrol 

• Scanner per image plates, DENOPTIX

• Microscopio a luce polarizzata Leitz Ortolux con controllo di temperatura e telecamera digitale

• Microscopio a contrasto di fase Leica DMLS

• Generatore Philips DY673 con monocromatore e camera di Guiner con Image Plate

• Generatore Ital-Structures C3K5 con monocromatore e camera di Guinier con Image Plate

• Macchina fotografica digitale Nikon D5100

• Liofilizzatore Edwards

• Sistema  per elettroporazione e cellule con elettrodi

Staff

Prof, Paolo Mariani p.mariani@univpm.it
Prof. Francesco Spinozzi f.spinozzi@univpm.it
Prof. Maria Grazia Ortore m.g.ortore@univpm.it
Dr. Valentina Notarstefano
Dr. Paolo Moretti
Dr. Alessia Pepe
Dr. Adnan Khan
Dr. Eleonora Mari
Dr. Matteo Vercelli
Dr. Jessica Roque

Link alle pubblicazioni del Laboratorio